體視鏡落射熒光照明圖解
最近，研究者已經(jīng)可以在配有高數(shù)值孔徑物鏡的顯微鏡上搭配熒光觀察方法。隨著生物特異性的熒光蛋白（如綠色熒光蛋白，GFP）的出現(xiàn)，熒光觀察也開始出現(xiàn)在體視鏡上。
由于體視鏡的視野及工作距離大，通過體視鏡熒光照明，研究者可以分辨出表達熒光蛋白的生物，如線蟲，斑馬魚，卵母細胞，成熟的昆蟲等。同時，研究者們可使用鑷子，滴管或其他顯微操作設備處理樣品。另外，在體視鏡下，體視熒光照明更利于樣品的觀察記錄。
體視鏡的熒光照明器與復合式顯微上的相同。熒光照明器中有氙燈或汞燈作為光源，外罩一個燈室，燈室通過垂直照明器與顯微鏡機身相連。如Figure1,2，垂直照明器位于機身的變倍體與觀察筒之間。
下面我們以Nikon SMZ1500體視鏡為例，介紹下體視熒光的光路。
由光源發(fā)出的光經(jīng)過匯聚透鏡到達濾色塊組中的激發(fā)光濾光片，在這里，光源中的光只有一部分（某段特定的波長）能夠通過濾片。透過濾片的光被半透半反鏡反射，經(jīng)過機身下部的變倍體透鏡組，物鏡，到達樣品。半透半反鏡的具有反射小于特定波長的光，而使大于特定波長的光透過的特性。
透過物鏡的光已倒錐形照射到樣品上，激發(fā)與之相應的熒光物質(zhì)。發(fā)射出的熒光透過物鏡，中間變倍體，到達發(fā)射光濾光片；在這里，又會有一部分光被濾掉，只有被激發(fā)出的熒光會通過發(fā)射光濾光片。Figure1,2 中顯示的為光路構想圖。左側的光路中，發(fā)射出的熒光直透過達發(fā)射光濾光片，然后進入相機或目鏡觀察筒；右側的光路中的發(fā)射光要先透過過半透半反鏡，再透過發(fā)射光濾光片，最后進入目鏡觀察筒。
Figure2,3為熒光濾色塊組示意圖。每個濾色塊組有一個半透半反鏡，一個激發(fā)光濾光片，兩個發(fā)射光濾光片。如前面介紹的，由光源發(fā)出的光透過激發(fā)光濾光片進入濾色塊組，被半透半反鏡反射；發(fā)射出的熒光透過發(fā)射光濾光片進入目鏡或相機。在這一組合中，半透半反鏡以及左側的發(fā)射光濾光片是固定在架子上的，而右側的發(fā)射光濾光片則安裝在一個可以拆卸的濾片框內(nèi)。只要松動螺絲，就可以拆下右側的濾片框，然后根據(jù)需要，更換半透半反鏡。更換時需要注意，不要把固定用的膠水，涂到半透半反鏡上，操作要帶手套，避免將指紋留在鏡面上。
上述體視鏡可搭配3各熒光濾色塊，以及一個用于明場觀察的無濾片塊。觀察時，可通過拉動杠桿調(diào)節(jié)濾色塊的位置，每一個濾色塊配有不同的標識，便于選擇。
Table1中為Nikon提供的多種濾色片組合。這些濾色片涵蓋了熒光激發(fā)/發(fā)射的大部分波長范圍（激發(fā)波段380nm-510nm的染料都適用），適用于生物學研究及工業(yè)研究。同時，下列組合也適用于綠色熒光蛋白變種的研究，如cyan及藍色熒光蛋白。在活細胞觀察中，選擇適當?shù)臑V色片組合會極大的提高信號的強度。另外，考慮到葉綠素的自發(fā)熒光，當選擇為植物觀察特別設計的濾片組。
體視鏡熒光濾片組合:
| 濾片組 | 激發(fā)光波段 | 半透半反鏡 | 發(fā)射光波段 |
| Blue GFP/DAPI | 379-401 nm | 420 nm (DCLP) | 435-485 nm |
| Cyan (EGFP) GFP | 426-446 nm | 455 (DCLP) | 460-500 nm |
| Endow GFP 帶通 | HQ 450-490 nm | Q 495 (LP) | 500-550 nm |
| Endow GFP 長通 | HQ 450-490 nm | Q 495 (LP) | 500 nm (LP) |
| TRITC (DsRed) | HQ 530-560 nm | Q 570 (LP) | 590-650 nm |
| Yellow GFP 帶通 | HQ 490-510 nm | Q 515 (LP) | 520-550 nm |
長時間高強度光照及紫外線照射將會對濾色片造成損害，另外，環(huán)境的濕度也會對濾片的帶通造成影響。為了延長濾片的使用壽命，應該將濾片儲存在干燥器中，或者放置在有干燥器的密封箱內(nèi)。同時，應當減少濾片的曝光的時間，如不觀察的時候應該關閉光源的光閘，保護濾片。清潔濾片時應使用洗耳球，駝毛刷，或無油的氣體加壓器通過干燥的空氣進行清潔。千萬不可以使用擦鏡紙，它們會劃傷濾片上的鍍膜。
以Nikon SMZ1500為例，這款體視鏡的放大倍數(shù)為4x到540x，接近一臺復合式顯微鏡的放大倍數(shù)。研究者可以通過這樣的體視鏡觀察大體積的活樣品，或經(jīng)熒光標記的薄切片。Figure4為三色熒光染色的小鼠腎臟切片。使用的染料分別為DAPI, Alexa Fluor 488 WGA, 及 Alexa Fluor 568，相應的濾色片為Table1中的Blue GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, 及 TRITC DsRed。這張圖片體現(xiàn)了體視鏡具備了觀察復合式顯微鏡樣品的能力。
其他的顯微鏡制造商有著不同的提示熒光照明設計，如Figure5中為比較主流的模式之一。在這一設計中，有一個獨立于成像光路的熒光照明通道。由光源發(fā)出的光首先經(jīng)過激發(fā)光濾色片，然后通過主機后方的通道到達底部的透鏡組，這些透鏡組將光傳導到樣品上。這樣的設計保證了無論在何種放大倍數(shù)下，激發(fā)光都會直接照射在樣品上，范圍，發(fā)射光強度，黑背景都不隨放大倍數(shù)改變。發(fā)射出的熒光通過物鏡到達變倍體最后透過發(fā)射光濾光片，進入目鏡用于觀察或進入相機。這一設計主要的優(yōu)勢在于取消了半透半反鏡，并且濾片的組合可變，研究者可選的范圍很大。然而，這也帶來了相應的問題，如，沒有經(jīng)驗的操作者可能會因為選擇了錯誤濾片組合而觀察不到熒光。
由汞燈產(chǎn)生的強紫外線會損傷觀察者的視網(wǎng)膜。許多廠家為了避免這一事故都引用了保護設施濾掉照射在樣品及載物臺上的紫外線。同時還有很多其他的保護措施，如在光路中加入濾片。體視熒光鏡中通常在燈箱及垂直照明器之間裝有光閘，當不觀察樣品或不照相時，光閘將會關閉，以保護樣品不受長時間紫外線的傷害。有時在高倍平場復消色差物鏡（1.6x至2.0x）配合低變倍比的情況下，視野里較低的部分可能會出現(xiàn)反射及hot spots現(xiàn)象。這一假象通常在調(diào)高變倍比時消失。而且在使用低放大倍數(shù)物鏡（0.5x或1.0x）以及高放大倍數(shù)低校正物鏡（消色差物鏡，平場消色差物鏡）時不會出現(xiàn)這一假象。使用體視鏡可以觀察很多種樣品，如Table2,從生物到工業(yè)制造。
體視鏡熒光的應用
| 領域 | 應用 |
| 生物學 | 基因表達，細胞分類，解剖，發(fā)育過程，眼及肌肉的研究 |
| 植物學 | 植物細胞，組織自發(fā)熒光，鼓勵樣品，寄生蟲 |
| 藥理學 | 毛細流動,藥物，觀察 |
| 水文學 | 水質(zhì)，細胞結構，濾膜分析 |
| 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟學 | 種子觀察，基因表達，轉(zhuǎn)基因 |
| 電子學 | 焊膏，環(huán)氧樹脂分析，顯示器涂料，集成電路聚合物鑄件 |
| 半導體 | 光阻污染，外來顆粒，加工錯誤 |
| 聚合物 | 外來顆粒，空隙，珠粒分析，非聚合區(qū)域 |
| 金屬制造 | 裂縫及表面缺陷，污染，焊接控制，斷口分析 |
| 材料 | 裂縫，焊接，碳鍵，斷裂，定位研究 |
| 造紙 | 纖維包被及內(nèi)含物 |
| 法醫(yī)學 | 紡織纖維，體液，指紋，銀行票據(jù)，贗品 |
與復合式顯微鏡相比，大工作距離及景深使體視熒光能夠提供全景信息并觀察高強度熒光。這些特性為研究者們帶來了很多便利，比如可以操作大的生物樣品，或者材料技術師可在此進行包埋，檢查電子元件，或切割�，F(xiàn)在特殊用途的濾片組合越來越豐富，體視熒光鏡也將得到更好的發(fā)展。