光學(xué)顯微鏡觀察方式大盤(pán)點(diǎn)：相差

時(shí)間：2024年07月31日

光學(xué)顯微鏡觀察方式大盤(pán)點(diǎn)：相差

光學(xué)顯微鏡適用于多種檢材，如組織切片、活細(xì)胞、電路板等。不同檢材光學(xué)特性差異大，需使用不同觀察方式，主要有明場(chǎng)、相差、熒光、偏光、DIC、暗場(chǎng)、霍夫曼相襯七大方式。

一臺(tái)光學(xué)顯微鏡可能擁有一種或多種觀察方式，上期我們介紹了明場(chǎng)，今天來(lái)說(shuō)說(shuō)相差觀察方式。

1935年荷蘭物理學(xué)家澤尼克（Frits Zernike）發(fā)現(xiàn)相襯原理并應(yīng)用到顯微鏡上，主要用于觀察活細(xì)胞等無(wú)色透明樣品，此種觀察方式稱為相差觀察、相襯觀察或澤尼克相襯觀察，在生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。

（1）成像原理

人眼只能在光波的波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度）有變化的情況下，才能區(qū)分被檢物體。對(duì)于和周圍介質(zhì)折射率相差不大的透明狀物體，光線通過(guò)物體時(shí)波長(zhǎng)和振幅變化不顯著，難以分辨。

左圖：明場(chǎng)觀察的酵母，對(duì)比度差

右圖：相差觀察的酵母，輪廓和細(xì)節(jié)清晰

培養(yǎng)基與細(xì)胞、細(xì)胞器與細(xì)胞質(zhì)之間都有明確的分界面，當(dāng)光線通過(guò)這些界面時(shí)，一部分光直射通過(guò)，另一部分?jǐn)y帶界面圖像信息的光則成為衍射光。直射和衍射光波長(zhǎng)一致，因此顏色一致，衍射光的光程（相位）比直射光多1/4個(gè)波長(zhǎng)，但人眼無(wú)法區(qū)分。相差觀察利用光的干涉原理，將這個(gè)光程相位差，轉(zhuǎn)換成振幅（亮度）變化，從而提升了分界面的襯度，讓人眼可以區(qū)分。

相差原理光路圖

兩束波的疊加，上圖為相隔π/2相位的疊加波，疊加后的波形振幅得到加強(qiáng)，表現(xiàn)為變亮；下圖為相隔π相位的疊加波，疊加后的波形振幅被減弱，表現(xiàn)為變暗

（2）關(guān)鍵部件

相差觀察需要相差聚光鏡和相差物鏡兩個(gè)特殊部件，其效果還會(huì)受光源光強(qiáng)影響，因?yàn)閺拿鲌?chǎng)切換到相襯時(shí)會(huì)顯著降低成像亮度。

①相差聚光鏡是在光源與聚光鏡之間加入相差環(huán)（環(huán)形光闌annular diaphragm）實(shí)現(xiàn)的，作用是使透過(guò)聚光鏡的光線形成環(huán)形光。相差環(huán)的環(huán)狀孔（中空環(huán)）直徑和孔寬與物鏡內(nèi)的相位環(huán)板匹配，形成的像恰好落在物鏡后焦面與相位板上的共軛面重合，因此不同倍數(shù)物鏡要與不同倍數(shù)的環(huán)匹配。

相差環(huán)可通過(guò)推拉環(huán)板、轉(zhuǎn)盤(pán)聚光鏡等形式切換進(jìn)出光路，倒置顯微鏡通常使用聚光鏡相差環(huán)板推拉實(shí)現(xiàn)切換。

相差環(huán)板，內(nèi)嵌兩個(gè)相差環(huán)和一個(gè)明場(chǎng)通道

產(chǎn)品小知識(shí)：相差環(huán)附近有對(duì)中螺絲，用于對(duì)中相差環(huán)，非必要勿擰

②相位板（annular phaseplate）：相差物鏡鏡片中有氟化鎂等材料制作的的相位板，是相差效果的核心。按相差物鏡種類可分為正相差和負(fù)相差，正相差常見(jiàn)，物鏡標(biāo)記Ph，背景變暗，樣品邊界外圍形成白色光環(huán)。

負(fù)相差比較少見(jiàn)，物鏡標(biāo)記Nh，背景非常暗，樣品邊界內(nèi)圍形成白色光環(huán)。

帶有相位板的相差物鏡，一般會(huì)標(biāo)注Ph字樣

使用小技巧：相襯物鏡光通過(guò)率會(huì)降低，一般只適合明場(chǎng)和相差使用。對(duì)于iPS細(xì)胞和ES細(xì)胞等需要使用塑料培養(yǎng)皿的樣品，建議選購(gòu)明美半復(fù)消色差的相襯物鏡，才能同時(shí)滿足相差和熒光觀察。

③對(duì)中望遠(yuǎn)鏡 (centering telescope)：也叫合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，是用于調(diào)中相襯環(huán)的配件，未調(diào)中的相差環(huán)會(huì)導(dǎo)致相差效果大打折扣。

對(duì)中望遠(yuǎn)鏡

對(duì)中望遠(yuǎn)鏡調(diào)節(jié)相差環(huán)對(duì)中

（3）成像特點(diǎn)

相襯觀察成像特征是變暗的背景和樣品邊緣出現(xiàn)較厚的白色光環(huán)，主要用來(lái)看活細(xì)胞、水生物、薄組織切片之類透明樣品，可以呈現(xiàn)樣品細(xì)節(jié)，在厚度5-10μm時(shí)效果較好，厚樣品、非透明樣品看起來(lái)可能跟明場(chǎng)差不多。