摘 要：采用顯微成像熒光光譜系統(tǒng)對退變（病變）的軟骨及健康軟骨樣本不同深度位置進(jìn)行顯微探測和熒光光譜采樣。結(jié)果顯示：在非鈣化區(qū)，退變樣本的３４０／４１４nm 熒光光譜強(qiáng)度低于健康樣本，而在鈣化區(qū)和骨質(zhì)區(qū)，退變樣本熒光強(qiáng)度則高于健康樣本；２ 類樣本在鈣化區(qū)和骨質(zhì)區(qū)的熒光光譜強(qiáng)度均高于非鈣化區(qū)。利用顯微成像熒光光譜技術(shù)研究關(guān)節(jié)軟骨提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和病變特征，有助于相關(guān)疾病的早期監(jiān)測及診斷研究。

顯微成像熒光光譜技術(shù) 利用該技術(shù)可以同時(shí)獲得樣品的熒光光譜信息以及顯微形貌，有利于同時(shí)實(shí)現(xiàn)其組織內(nèi)部成分及外部微觀形態(tài)的觀測。此外，該技術(shù)具有檢測速度快、信號(hào)強(qiáng)度高、對樣品要求低、易于標(biāo)記、活體測量不易受水分影響等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛運(yùn)用于多個(gè)領(lǐng)域的基礎(chǔ)科學(xué)研究及應(yīng)用研究。

生物熒光光譜技術(shù)可以檢測光和組織的相互作用，并提供有關(guān)分子、細(xì)胞和組織的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)信息，是生物醫(yī)學(xué)研究和診斷的１ 個(gè)重要手段。它的２ 個(gè)至關(guān)重要的熒光光譜特征參量是熒光強(qiáng)度和波長。前者是在激發(fā)光的作用下樣品所發(fā)射的熒光強(qiáng)度，它與激發(fā)光的波長、樣品的構(gòu)成、分子結(jié)構(gòu)、濃度、所處的環(huán)境等因素有關(guān)，反映相關(guān)熒光物質(zhì)的分子屬性及含量。

關(guān)節(jié)軟骨是一類透明軟骨，表面平滑，有利于關(guān)節(jié)的彎曲、潤滑、減震和緩沖等，在人和動(dòng)物的日常運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著重要的生理功能。軟骨主要由軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞組成，軟骨基質(zhì)的主要成分為膠原蛋白和蛋白多糖、以及水和少量無機(jī)離子。

關(guān)節(jié)軟骨從軟骨外表面至骨質(zhì)之間可分為非鈣化區(qū)（含表層區(qū)（SZ） 、過渡區(qū)（TZ）和深層區(qū)（DZ））與鈣化區(qū)（CZ） ，深層區(qū)與鈣化區(qū)之間有１ 條潮線相隔，鈣化區(qū)下方為骨質(zhì)區(qū)。在關(guān)節(jié)軟骨的各個(gè)分區(qū)內(nèi)，各主成分的含量及結(jié)構(gòu)均有不同。當(dāng)膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，PG 出現(xiàn)流失時(shí)，即意味著軟骨退變甚至骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

目前，已有一些科學(xué)家針對關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行了熒光光譜研究。１９９１ 年，Akiyoshi［３ ］ 分析了老化的人關(guān)節(jié)軟骨的熒光特性，指出戊糖的波長為３３５／３８５nm ，嘧啶為２９５／３９５ nm 。２００１ 年，Gibson 等 觀察到了３７０／４４０ nm 附近的特征峰，并提出該特征峰代表了糖化膠原的熒光強(qiáng)度。２０１２ 年，Kinnunen 等利用蘇阿糖溶液對軟骨樣本進(jìn)行培養(yǎng)來模擬軟骨退變，并通過熒光分光光度計(jì)檢測到了糖基化終產(chǎn)物（AGE）的積累，以及戊糖和賴氨酸嘧啶濃度的增加。２０１６ 年，國內(nèi)研究者對軟骨的熒光顯微檢測方法進(jìn)行了研究，對熒光強(qiáng)度圖像進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)處理，發(fā)現(xiàn)了健康樣本與病變樣本的差異，并基于熒光的偏振敏感特性，利用線性二色性方法揭示了軟骨組織存在的熒光各向異性特征。但過去的這些研究都沒有能夠?qū)晒夤庾V和顯微成像相結(jié)合進(jìn)行軟骨（及下骨）病變條件下的主成分含量變化研究。

由于關(guān)節(jié)軟骨的特征構(gòu)成，其主成分的（自發(fā)）熒光特征（強(qiáng)度）也相對比較明顯。因此，利用顯微成像熒光光譜技術(shù)對其進(jìn)行研究和表征，將會(huì)獲得非常明顯而具說服力的結(jié)果，為后續(xù)的關(guān)節(jié)疾病研究和相關(guān)應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

以下為研究者所做的樣品實(shí)驗(yàn)圖

退變樣本由表及里依次標(biāo)記為A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 和骨質(zhì)區(qū)；

健康樣本由表及里依次標(biāo)記為A 、B 、C 、D 、E 、F 和骨質(zhì)區(qū)。

圖1 退變和健康軟骨樣本的顯微成像

１ — ３ 分別來自健康樣本A 、C 、B ；

４ — ６ 分別來自退變樣本C 、A 、B ；

７為背景光譜。

圖2 軟骨的熒光光譜（以５４０nm 譜帶為歸一化內(nèi)標(biāo)）

所有熒光光譜。隨著采樣位置深度的增加（A → 骨質(zhì)區(qū)） ，熒光強(qiáng)度逐漸增加，尤其是從非鈣化區(qū)到鈣化區(qū)。所不同的是，健康樣本骨質(zhì)區(qū)的熒光強(qiáng)度分別高于鈣化區(qū)和軟骨區(qū)，而退變樣本骨質(zhì)區(qū)的熒光強(qiáng)度則低于鈣化區(qū)熒光強(qiáng)度。

結(jié) 論

采用顯微成像熒光光譜技術(shù)，對健康軟骨切片樣本與退變軟骨切片樣本的顯微成像和熒光光譜進(jìn)行了分析，獲得了熒光特征強(qiáng)度隨深度的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了退變發(fā)生時(shí)軟骨中主成分的變化情況，為軟骨退變及骨關(guān)節(jié)炎的研究打下了基礎(chǔ)。

以上文章部分內(nèi)容引自南京航空航天大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院尹建華教授相關(guān)文獻(xiàn)，特此感謝！