自從美國科學(xué)家威拉德.博伊爾和喬治.史密斯于1969年發(fā)明了半導(dǎo)體集成電路成像技術(shù),CCD 感應(yīng)器。 CCD 數(shù)碼成像對攝影產(chǎn)生了革命性的影響。在感光膠片之外,人們可以通過電子電路捕捉圖像,這些以數(shù)字形式存在的圖像更加易于處理和分發(fā)。數(shù)字圖像已經(jīng)成為許多研究領(lǐng)域中不可替代的重要工具。
數(shù)碼成像技術(shù)應(yīng)用到顯微鏡上,以替代以往的膠卷拍攝,現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用了。以前我們用膠卷來進(jìn)行顯微拍攝,要等一卷拍完,沖洗出來才能確定拍攝的圖像是否清晰,如果拍攝的圖像不理想,而顯微觀察的樣品又失效了,就需要重新制作樣品,給研究工作帶來很大的不便,而現(xiàn)在使用顯微鏡攝像頭來拍攝顯微圖像,所見即所得,當(dāng)時(shí)就是保存處理,甚至統(tǒng)計(jì)分析,極大的提高了工作效率。
二、顯微鏡攝像頭的組成
顯微鏡攝像頭包括 CCD / CMOS 專業(yè)相機(jī),圖像采集處理軟件,顯微鏡接口,數(shù)據(jù)傳輸線等,其中最核心的設(shè)備是 CCD 和 CMOS 圖像傳感器,前者由光電耦合器件構(gòu)成,后者由金屬氧化物器件構(gòu)成。兩者都是光電二極管結(jié)構(gòu)感受入射光并轉(zhuǎn)換為電信號,主要區(qū)別在于讀出信號所用的方法。
CCD (Charge Coupled Device ,感光耦合組件)上感光組件的表面具有儲存電荷的能力,并以矩陣的方式排列。當(dāng)其表面感受到光線時(shí),會將電荷反應(yīng)在組件上,整個 CCD 上的所有感光組件所產(chǎn)生的信號,就構(gòu)成了一個完整的畫面。 CCD 的結(jié)構(gòu)分三層 ,第一層“微型鏡頭”“ON-CHIP MICRO LENS”,這是為了有效提升 CCD 的總像素,又要確保單一像素持續(xù)縮小以維持 CCD 的標(biāo)準(zhǔn)面積,在每一感光二極管上(單一像素)裝置微小鏡片。 CCD 的第二層是“分色濾色片”,目前有兩種分色方式,一是RGB原色分色法,另一個則是CMYG補(bǔ)色分色法。原色 CCD 的優(yōu)勢在于畫質(zhì)銳利,色彩真實(shí),但缺點(diǎn)則是噪聲問題。第三層:感光層,這層主要是負(fù)責(zé)將穿過濾色層的光源轉(zhuǎn)換成電子信號,并將信號傳送到影像處理芯片,將影像還原。
數(shù)碼成像的核心器件除 CCD ,現(xiàn)在越來越多的使用 CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor,互補(bǔ)性氧化金屬半導(dǎo)體, CMOS 和 CCD 一樣同在數(shù)碼相機(jī)中可記錄光線變化的半導(dǎo)體。 CMOS 傳感器中每一個感光元件都直接整合了放大器和模數(shù)轉(zhuǎn)換邏輯,當(dāng)感光二極管接受光照、產(chǎn)生模擬的電信號之后,電信號首先被該感光元件中的放大器放大,然后直接轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的數(shù)字信號。 CMOS 的優(yōu)勢在于成本低,耗電需求少,便于制造, 可以與影像處理電路同處于一個芯片上,缺點(diǎn)是較容易出現(xiàn)雜點(diǎn)。
三 顯微鏡攝像頭相關(guān)參數(shù)
對 CCD / CMOS 數(shù)碼成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和原理有了一個基本了解后,我們再對成像系統(tǒng)的一些基本參數(shù)作一個說明。在實(shí)際應(yīng)用中,很多用戶對像素多少很敏感,一上來就提到我要多少萬像素的成像系統(tǒng),其實(shí)在專業(yè)成像應(yīng)用中,像素多少只是影響成像的一個因素,還有其他很多指標(biāo),包括分辨率,感光器件大小,動態(tài)范圍,靈敏度,量子效率,信噪比等。
感光器件的面積大小是衡量顯微鏡攝像頭質(zhì)量的一個重要指標(biāo),感光器件的面積越大,捕獲的光子越多,感光性能越好,信噪比越低。當(dāng)前數(shù)碼成像系統(tǒng)中較常應(yīng)用的感光器件規(guī)格如下:1英寸(靶面尺寸為寬12.7mm*高9.6mm,對角線16mm),2/3英寸, 1/2英寸,1/3英寸,另外有時(shí)也用到1/1.8英寸,1/2.5英寸的 CCD / CMOS 感光器件。
像素是 CCD / CMOS 能分辨的最小的感光元件,顯微鏡攝像頭的像素由低到高有:45萬左右,140萬左右,200萬左右,300萬左右,500萬左右,900萬像素,甚至還有更高的達(dá)到2000萬像素以上。一般來說,像素越高,圖像分辨率越高,成像也就越清晰,但有時(shí)候圖像分辨率達(dá)到一定程度后,就不是影響成像質(zhì)量的主要指標(biāo)了。比如圖像分辨率高,噪聲也很高時(shí),成像質(zhì)量也不會很好。暗電流是導(dǎo)致 CCD 噪音的很重要的因素。暗電流指在沒有曝光的情況下,在一定的時(shí)間內(nèi), CCD 傳感器中像素產(chǎn)生的電荷。我們在做熒光拍攝的時(shí)候,需要的曝光的時(shí)候比較長,這樣導(dǎo)致 CCD 產(chǎn)生較多的暗電流,對圖像的質(zhì)量影響非常大。通常情況下通過降低 CCD 的溫度來最大限度的減少暗電流對成像的影響。Peltier制冷技術(shù)一般可將 CCD 溫度降低5-30°C,在長時(shí)間拍攝或一次曝光超過5-10秒, CCD 芯片會發(fā)熱,沒有致冷設(shè)備的芯片,“熱”或者白的像素點(diǎn)就會遮蓋圖像,圖像會出向明顯的雪花點(diǎn)。 CCD 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、數(shù)字化的方法等都會影響噪音的產(chǎn)生。當(dāng)然通過改善結(jié)構(gòu)、優(yōu)化方法,同樣能減少噪音的產(chǎn)生。顯微熒光或其他弱光的拍攝對 CCD 噪音的降低要求很高,應(yīng)選用高分辨率數(shù)字冷卻 CCD 成像系統(tǒng),使其能夠捕獲到信號極其微弱的熒光樣品圖像,并且能夠最大程度的降低噪音,減少背景,提供出色的圖像清晰度。所以一般在熒光及弱光觀察時(shí)需要選擇制冷 CCD 。
在顯微數(shù)碼成像過程中,對于熒光及弱光的拍攝,除了制冷降低熱噪聲外,還可使用 BINNING技術(shù)提高圖像的靈敏度,BINNING像素合并是一種非常有用的功能,它可被用來提高像素的大小和靈敏度,比如攝像頭像素大小為5u,當(dāng)經(jīng)過2x2合并后,像素大小為10u,3X3合并后,像素大小為15u, 這是圖像的整體像素變少了,但成像的靈敏度可提高9倍。
動態(tài)范圍表示在一個圖像中最亮與最暗的比值。12bit表示從最暗到最亮等分為212=4096個級別,16bit即分為216個級別,可見bit值越高能分出的細(xì)微差別越大,一般 CMOS 成像系統(tǒng)動態(tài)范圍具有8-10bit, CCD 以10-12bit為主,少部分可達(dá)16bit。對動態(tài)范圍進(jìn)行量化需要一個運(yùn)算公式,即動態(tài)范圍值 = 20 log (well depth/read noise),動態(tài)范圍的值越高成像系統(tǒng)的性能就越好。
量子效率也稱像素靈敏度,指在一定的曝光量下,像素勢阱中所積累的電荷數(shù)與入射到像素表面上的光子數(shù)之比。不同結(jié)構(gòu)的 CCD 其量子效率差異很大。比如100光子中積累到像素勢阱中的電荷數(shù)是50個,則量子效率為50%(100 photons = 50 electrons means 50% efficiency)。值得注意的是 CCD 的量子效率與入射光的波長有關(guān)。
對顯微鏡攝像頭的參數(shù)有了整體認(rèn)識后,在實(shí)際應(yīng)用中選擇合適型號的產(chǎn)品就比較容易了。高分辨率顯微數(shù)碼成像技術(shù)在國外已有二十來年的發(fā)展歷史,產(chǎn)品目前已比較成熟。國外的專業(yè)數(shù)碼產(chǎn)品有多個品牌,比較著名的有德國的ProgRes,美國Roper Scientific的系列產(chǎn)品,另外OLYMPUS、NIKON、LEICA、ZEISS等顯微鏡廠家也有一些配套的專業(yè)數(shù)碼成像系統(tǒng) 。其中 CCD 成像系統(tǒng)主要采用SONY及KODRA公司的芯片,因此相關(guān)產(chǎn)品性能差別不是很大。
國內(nèi)專業(yè)數(shù)碼成像產(chǎn)品的設(shè)計(jì)制造時(shí)間還不長,但隨著配套技術(shù)的成熟,100萬像素以上的 CCD / CMOS 專業(yè)數(shù)碼成像產(chǎn)品開始陸續(xù)推出,主要的專業(yè)廠家有北京的大恒、微視、杭州歐普林,廣州明美等企業(yè)。北京大恒早期主要研發(fā)生產(chǎn)圖像采集卡,目前可以量產(chǎn)140萬像素的 CCD 攝像頭,130萬/200萬/320萬/500萬像素 CMOS 攝像頭,主要用到工業(yè)領(lǐng)域。廣州明美是國內(nèi)少數(shù)專業(yè)從事顯微數(shù)碼成像產(chǎn)品研發(fā)與銷售的高新技術(shù)企業(yè),由于具有雄厚的顯微鏡技術(shù)背景,明美推出的130萬-900萬系列 CMOS 專業(yè)成像系統(tǒng),1/2\ 2/3 寸140萬像素、300萬像素的 CCD 顯微鏡攝像頭,都專門針對顯微成像的特點(diǎn),對底層驅(qū)動軟件進(jìn)行了修正,使之顯微成像操作更方便,色彩還原更真實(shí),清晰度更高。
顯微鏡攝像頭一般都是在電腦上預(yù)覽與保存,因此需要配套的相應(yīng)的圖像采集及處理軟件,這方面國內(nèi)由于知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)等原因,很多公司對軟件的開發(fā)重視程度不夠,認(rèn)為硬件開發(fā)出來就萬事大吉了,結(jié)果很多國產(chǎn)的成像系統(tǒng)的控制調(diào)節(jié)不方便,功能有限,需要專業(yè)的操作人員才能得到好的圖象,影響了市場的普及推廣,不過最近兩年這種情況有了明顯的改進(jìn),明美光電,歐普林科技等公司都推出了配套的功能豐富的軟件系統(tǒng)。
2009年中,明美在國內(nèi)首家推出了采用SONY芯片的500萬像素冷 CCD 顯微鏡攝像頭MC50,其相關(guān)技術(shù)指標(biāo)達(dá)到了國際知名的Roper Scientific公司MP5.0的標(biāo)準(zhǔn),實(shí)際拍攝效果與進(jìn)口產(chǎn)品相比也毫不遜色,操作人性化方面則更勝一籌,最重要的是,MC50的價(jià)格只有國外同類產(chǎn)品的一半左右,這樣會大大推動高端顯微鏡攝像頭的應(yīng)用與普及,真正打破了國外廠家在專業(yè)高端數(shù)碼成像領(lǐng)域的壟斷。
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